免疫荧光实验

免疫荧光实验应用范围：

　　其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、药物检测、免疫学、血型鉴定等。

基本实验步骤：

　　1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

　　2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.

　　3、通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

　　4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.

　　5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.

　　6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

　　7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

注意事项：

　　1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。

　　2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。

　　3、二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

　　4、整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

　　5、洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

　　6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

　　7、细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可，之后片子可保留更长时间。

常见荧光素的特性：

　　1、FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。

　　2、RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。

　　3、TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。

　　4、镧系：Eu、Tb

　　5、PE：吸收光490~560nm，发射光 595nm，红色荧光。

Western blot、ELISA、免疫荧光、免疫组化的区别：

　　免疫组化或免疫荧光：检测蛋白表达，为定性实验为主，一般应用于组织居多，细胞应用较少，细胞可以使用免疫荧光实验。主要用于考察蛋白的定位、共定位等情况。

　　推荐应用：临床组织、动物组织标本的关键性蛋白检测。

　　western blot：检测蛋白表达或转录后修饰(磷酸化、剪切体、甲基化、苏素化、泛素化、乙酰化、多聚体、降解等)，与其他实验技术结合可以达到多种目的。应用最为广泛。细胞和组织都可以应用，也可以通过提取不同亚细胞组成用于检测蛋白的定位情况。为半定量实验。

　　推荐应用：细胞或组织中通路蛋白、一般蛋白的表达或转录后修饰。

　　ELISA：为定量实验，主要用于分泌型蛋白的检测居多。也可以用于动物血清、组织、细胞上清的蛋白检测。但是不适用于蛋白转录后修饰的检测，不推荐通路相关蛋白的检测。

　　推荐应用：细胞上清、组织、动物血清中分泌型蛋白，如细胞因子的检测。

什么时候选择免疫荧光，什么时候选择免疫组化?

　　免疫组化：适用于组织样本，不适用于检测多种蛋白的共定位、共表达，不适用于研究蛋白定位。

　　免疫荧光：适用于组织、细胞样本，适用于检测多种蛋白的共定位、共表达，适用于研究蛋白定位，适用于与FISH实验联合应用。

　　以上是关于免疫荧光实验相关的简单介绍，具体试验/检测周期、方法和步骤以与工程师沟通为准。北检研究院将持续跟进新的技术和标准，工程师会根据不同产品类型的特点，选取相应的检测项目和方法，以最大程度满足客户的需求和市场的要求。