细胞活力检测实验

　　北检院可提供MTT、CCK8、SRB、CFSE标记、Ki67染色、EdU、克隆形成等细胞活力检测实验

细胞活力、细胞增殖检测技术手段

MTT法：

　　MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿pu药物筛选、细胞毒性试验以及肿pu放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

CCK-8法：

　　CCK-8试剂盒是Cell Counting Kit-8的简称。其原理是用WST-8四唑盐(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)- 3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazupum)能被活细胞内的脱氢酶还原成橙色甲臜染料，然后测定450 nm下的吸光值，生成的甲臜的量与活细胞数量成正比。

SRB法：

　　磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，主要用来检测细胞增殖情况。SRB是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合;在540 nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。SRB染色后不会像MTT法那样很容易变色，细胞固定染色后在96孔板中可以放置较长时间，因而受测定时间的影响较小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时间点固定的96孔细胞培养板可在同一时间测定，测定的吸光值结果不会受到明显影响。吸光值与SRB浓度作图时，在OD单位1.5—2.0以下为线性，当超出线形范围时，稀释后重新读数。虽然SRB法比其他检测方法操作步骤繁琐，但是由于时间可以自己掌握，不受限制，因此适用于高通量筛选。

CFSE标记法：

　　荧光染料CFSE， 也可称为CFDA SE(5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester) 即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。

　　当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞;而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性;同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，形成具有荧光的蛋白加合物。

　　因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半;以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞术检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。

Ki67染色：

　　Ki67 是一种标记细胞增殖状态的核抗原，主要表达于 G1 期、S 期、 G2 期及有丝分裂间期的细胞，但在 G0 期即静息状态的细胞中不表达。其功能与细胞增殖密切相关，因此 Ki67 常用于检测细胞的生长指数。

EdU细胞增殖检测：

　　EdU(5-Ethynyl-2’- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apullo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

　　与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)，可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。

克隆形成实验：

　　细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。实验方法包括平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，正常细胞克隆形成率弱，细胞强;初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强。由于克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

　　当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状

　　以上是关于细胞活力检测实验相关的简单介绍，具体试验/检测周期、方法和步骤以与工程师沟通为准。北检研究院将持续跟进新的技术和标准，工程师会根据不同产品类型的特点，选取相应的检测项目和方法，以最大程度满足客户的需求和市场的要求。