蛋白印迹验证分析

检测项目

总蛋白定量：通过BCA或Bradford法测定样品中的总蛋白浓度，确保上样量一致，是结果可比性的基础。

目标蛋白表达水平：检测特定蛋白在样本中的相对或绝对表达量，是Western Blot最核心的检测目的。

蛋白磷酸化状态：使用特异性磷酸化抗体，检测信号通路中关键蛋白的活化程度。

蛋白切割与修饰：验证蛋白是否发生剪切（如Caspase切割）或其他翻译后修饰（如泛素化、甲基化）。

蛋白二聚体/多聚体形成：在非还原条件下，检测蛋白是否通过二硫键或其他作用形成复合物。

蛋白亚细胞定位指示：通过分离不同细胞组分（如胞浆、核蛋白）进行检测，间接反映蛋白的定位。

抗体特异性验证：通过基因敲低/敲除样本或使用不同抗体表位，确认检测信号的特异性。

疾病生物标志物筛选：比较疾病组与对照组样本，筛选表达差异显著的潜在标志蛋白。

药物处理效应评估：分析药物处理后，特定靶点蛋白表达或修饰水平的变化，评估药效。

转基因/基因编辑验证：在细胞或动物模型中，验证外源基因的表达或内源基因编辑后的蛋白产物。

检测范围

细胞裂解液：来自培养细胞系的整体蛋白样品，是最常见的检测样本类型。

组织分浆液：来自动物或临床组织标本的蛋白提取物，用于在体水平研究。

血清或血浆样本：用于检测可溶性分泌蛋白或自身抗体，适用于临床诊断研究。

亚细胞组分：如线粒体、细胞核、膜蛋白等分离组分，用于定位研究。

免疫沉淀产物：通过IP/Co-IP得到的蛋白复合物，进一步分析互作蛋白。

重组蛋白：验证表达纯化的重组蛋白的分子量及抗原性。

植物蛋白提取物：适用于植物分子生物学研究，检测植物体内蛋白表达。

细菌或酵母裂解物：用于原核或真核微生物的蛋白表达鉴定。

病毒颗粒蛋白：分析病毒结构蛋白或病毒编码的宿主内表达蛋白。

脑脊液等其他体液：拓展至特殊体液，用于神经性疾病或局部病理研究。

检测方法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：根据分子量大小，在凝胶中分离变性和带负电荷的蛋白质混合物。

湿转法或半干转法：将凝胶中分离的蛋白质转移至固相支持膜（如PVDF或NC膜）上。

膜封闭：使用脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景。

一抗孵育：用针对目标蛋白的特异性一抗与膜上的抗原进行特异性结合。

二抗孵育：使用连接有酶（如HRP）或荧光基团的二抗，与一抗进行结合。

化学发光法检测：加入ECL底物，HRP催化底物发光，通过X光胶片或成像系统捕获信号。

荧光法检测：使用荧光标记二抗，直接在荧光成像仪上扫描信号，可实现多重检测。

显色法检测：使用能产生不溶性颜色沉淀的底物（如DAB/NBT），直接观察条带。

内参蛋白检测：平行检测看家蛋白（如β-actin, GAPDH），用于校正上样量差异。

图像分析与定量：使用ImageJ等软件对条带灰度值进行分析，计算目标蛋白的相对表达量。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，实现蛋白质按分子量分离的核心装置。

转印仪（转移槽）：提供电场，将凝胶中的蛋白质高效、均匀地转印至膜上。

电源：为电泳和转印过程提供稳定、可调节的电压和电流。

摇床：用于孵育抗体和洗膜过程中，确保溶液与膜充分、均匀接触。

化学发光成像系统：高灵敏度CCD相机配合暗箱，用于捕获和记录化学发光信号。

荧光成像系统：配备特定激发/发射滤光片，用于检测荧光标记信号。

X光胶片及暗盒：传统的化学发光信号记录方式，需在暗室中操作。

微量分光光度计: 用于测定蛋白样品浓度，确保准确上样。