lncRNA、ceRNA、miRNA、circRNA研究

　　lncRNA、ceRNA、miRNA、circRNA研究

　　circRNA/IncRNA/miRNA/ceRNA研究常用相关实验方法：

　　PCR、western blot,、荧光素酶报告基因、FISH、RNA pulldown、siRNA/shRNA/病毒/sgRNA转染、ChlP、EMSA、RIP等等。

一、ceRNA网路的功能分析：

　　针对cRNA网络中编码蛋白的基因，还可以研究这些基因的分子功能。分别从GO,KEGG富集等方面了解这些基因的功能。

二、研究常用实验ChlP、RIP、RNA pull--down、EMSA、荧光素酶报告基因的比较

ChlP:

　　通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA。将处于适当生长时期的活细胞

　　用甲醛交联后将细胞裂解，染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与DNA进行富集。采用低pH值条件反交联，DNA与蛋白质之间的Schiff键水解，释放DNA。通过对目标片段的纯化与检测获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。

　　研究目的：蛋白与DNA结合情况。

RIP:

　　RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀)，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析;即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

　　研究目的：蛋白与RNA结合情况。

RNA pull-dow:

　　使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他，成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

　　研究目的：蛋白与RNA结合情况。

EMSA:

　　凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobipty shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

　　研究目的：蛋白与DNA结合情况。

EMSA:

　　凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobipty shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

　　研究目的：蛋白与DNA结合情况。

荧光素酶报告基因：

　　荧光素酶的基因可以被合成并插入到性物体中或转染到细胞中，将不同类型的细胞(干细胞、T细胞等)标记上(即表达)荧光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。

　　研究目的：启动子激活情况。

三、研究常用实验siRNA、shRNA的选择

　　microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现iRNA的调节靶点。

　　研究目的：蛋白与RNA结合情况。

RNA pul-doWn:

　　使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

　　研究目的：蛋白与RNA结合情况。

EMSA:

　　疑胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobipty shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

　　研究目的：蛋白与DNA结合情况。

荧光素酶报告基因：

　　荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中，将不同类型的细胞(干细胞、T细胞等)标记上(即表达)荧光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。

　　研究目的：启动子激活情况。

　　siRNA和shRNA的区别：这里需要特别注意，当RNA不在细胞质而在细胞核时，一般需要选择sgRNA进行敲除或敲入，这个时候shRNA、siRNA由于无法进入细胞核，因此都无法实现敲减。

四、研究常用实验三种病毒的选择

慢病毒(Lentivirus)

　　慢病毒(lentivirus)是逆转录病毒的一种，是RNA病毒，需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒。慢病毒区别于一般的逆转录病毒，它可以感染分裂和非分裂细胞，并能将外源基因整合到宿主基因组上实现长期稳定的表达，是体外和体内基因传递的有效工具。

　　1)LV结构

　　慢病毒是一种有包膜的RNA病毒，直径为80-120m,呈二十面体对称结构、球形。病毒颗粒最外层是包膜(包膜蛋白决定了感染细胞的类型)，再往里依次为基质蛋白和衣壳，最里面是两条相同的正股RNA链和酶(逆转录酶、整合酶和蛋白酶)。

　　2)LV特点

　　① 慢病毒有广泛的宿主范围，能够有效地感染分裂细胞、非分裂细胞，特别适合于一些难转染的细胞(如原代细胞、干细胞、不分化的细胞)和对腺病毒感染具有较强免疫反应的细胞(如树突状细胞、单核细胞和间充质干细胞)等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加。

　　② 慢病毒能将外源基因有效地整合入宿主染色体上，介导目的基因稳定、长期的表达。因此，可以利用慢病毒建立稳定细胞株。

　　③ 适用范围更广，不仅能用于体外实验，还能用于活体动物模型，尤其是动物成瘤实验。

腺病毒(Adenovirus)

　　腺病毒(Adenovirus,Ad)是一种无包膜的DNA病毒，其copy不依赖于宿主细胞的分裂。腺病毒拥有近S0个血清型，大多数腺病毒载体都是基于血清型2和血清型5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的copy能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1基因的细胞中copy,因此是一种适用于治疗的高效控制系统。重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大并易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为载体的首选，被科研工作者广泛使用。

　　1)AdV结构

　　腺病毒是一种直径为90-100m的病毒颗粒，衣壳呈廿面体，由240个六邻体和12个五邻体组成。以五邻体蛋白

　　为基底由衣壳表面伸出12根纤毛，纤毛顶端形成头节区。五邻体和纤毛的头节区可与细胞表面的受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。

　　2)AdV特点

　　① 腺病毒感染的宿主细胞范围广，包括分裂细胞和不分裂细胞(某些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞除敘

　　② 腺病毒感染效率高，在最佳感染条件下，感染率可达100%。

　　③ 腺病毒的病毒滴度可以很高，纯化、浓缩后可达1012-13vp/ml(即1010-11pfu/ml)。

　　④ 腺病毒易于扩增，而其他病毒比如慢病毒和腺相关病毒需要重新包装。

　　⑤ 不整合到染色体中，无插入致突变性。

　　⑥ 腺病毒理化性质稳定，4℃：数周。-80℃：数年。

　　3)AdV种类

　　① AdVS

　　特点：缺失E1和E3基因，允许插入长约8kb的外源基因

　　功能：除免疫、血液类细胞外，感染大部分细胞

　　② AdV5/F35

　　特点：一个嵌合型腺病毒载体，主要结构是在AdVS的基础上，其受体结合位置的纤突(Fiber)改造成了F35型腺病毒(F35)的纤突(纤毛蛋白的Knob和shaft)。其细胞受体从AdV5的CAR变成了CD46,其他的基因仍引旧保留AdV5载体的特性，能有效转导CAR表达不足的多种重要靶细胞，尤其是对中瘤细胞及造型干细胞、间充质干细胞等有较高的感染效率。

　　功能：理论上感染所有有细胞核的细胞

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)

　　腺相关病毒(Adeno-associated virus)属于细小病毒科，Dependoparvovirus属，是目前发现的一类结构简单、无包膜的单链DNA缺陷型病毒，它的生命周期依赖于cOpy病毒的参与，如腺病毒和单纯疱疹病毒。野生型的腺相关病毒可以定点整合到人类第19号染色体的AAVS1位点，而重组腺相关病毒由于缺少整合和copy必需的两个基因而无法整合。因此，重组腺相关病毒主要以游离于染色体的附加体形式存在，并可长时间存在于非分裂细胞中。另外，腺相关病毒具有高组织特异性、良好的扩散性、低免疫原性、高安全性和稳定性。基于以上特点，重组腺相关病毒已经成为科研和基因治疗中具市场前景的病毒载体之一。

　　AAV血清型

　　现阶段研究人员已发现12种人类AAV血清型(AAV1至AAV12)和100多种非人类灵长动物AAV血清型。不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性，因而其识别与结合的细胞表面受体也相应有很大差别，这也导致不同血清型转染的组织类型、细胞类型和感染效率也各不相同。表一是人类AAV1至AAV9识别的细胞表面受体;表二是AAV1至AAV9的不同组织亲噬性。

　　以上是关于lncRNA、ceRNA、miRNA、circRNA研究相关的简单介绍，具体试验/检测周期、方法和步骤以与工程师沟通为准。北检研究院将持续跟进新的技术和标准，工程师会根据不同产品类型的特点，选取相应的检测项目和方法，以最大程度满足客户的需求和市场的要求。