AhdI检测体系包含五大核心验证模块：
酶活性测定：通过λDNA标准底物切割实验计算单位时间内的酶切效率（U/μL），采用终点法测定37℃条件下1小时完全消化1μg DNA所需的酶量
特异性验证：使用含GACNNNNGTC特异识别位点的合成DNA片段进行双盲测试，验证非目标位点的零切割率及目标位点的完全消化率
纯度分析：通过SDS-PAGE电泳测定蛋白质纯度（≥95%），HPLC检测核酸外切酶残留量（≤0.01%）及宿主蛋白污染（≤0.1%）
稳定性测试：-20℃长期储存（12个月）及4℃短期保存（72小时）后的活性衰减率测定
Star活性筛查：在高浓度酶（10×推荐用量）及非标准缓冲体系下进行异常切割模式监测
本检测方案适用于以下生物样本类型：
| 样本类别 | 处理要求 | 关键参数 |
|---|---|---|
| 重组表达AhdI酶液 | 浓度≥5mg/mL；保存于50%甘油-Tris缓冲液 | 比活性≥20,000U/mg |
| 冻干酶制剂 | 水分含量≤3%；复溶后pH7.5±0.3 | 批次间活性差异≤5% |
| 基因工程产物 | DNA底物长度≥10kb；超螺旋占比≥90% | 非特异性切割位点≤1个/μg DNA |
| 诊断试剂组分 | 符合ISO13485体系要求；内毒素≤10EU/mL | DNase/RNase残留未检出 |
执行标准参照《分子生物学用工具酶检验规程》（GB/T 34797-2017）及《中国药典》四部通则：
琼脂糖凝胶电泳法
配制1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）
反应体系：1μg λDNA+10×缓冲液+梯度稀释酶液（0.1-10U），37℃孵育60分钟
终止反应后电泳（5V/cm×40min），通过DNA条带迁移率计算完全消化所需最小酶量
高效液相色谱法（HPLC）
色谱柱：TSKgel G3000SWxl（7.8mm×30cm）
流动相：50mM磷酸钠+150mM NaCl（pH6.8）流速0.5mL/min
紫外检测波长280nm，通过峰面积积分计算主成分占比
荧光定量PCR法
设计跨越GACNNNNGTC位点的TaqMan探针（FAM标记）
建立标准曲线测定未切割模板量与Ct值的线性关系（R²≥0.99）
计算酶切效率=1-(切割后模板量/初始模板量)×100%
微量热泳动技术（MST）
使用Monupth NT.115设备进行结合常数测定
荧光标记DNA探针与AhdI的Kd值应≤10nM
温度梯度设定：22-40℃（ΔT=6℃/min）
主要配置设备及其技术参数如下：
Nanodrop OneC超微量分光光度计
• 波长范围：190-850nm
• 光程调节：0.05mm（高浓度模式）-10mm（低浓度模式）
• 重复性误差：≤1.5%（BSA标准品）
Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统
• 像素分辨率：4.2百万（2048×2048）
• 动态范围：4个数量级（化学发光模式）
• 标配Ethidium Bromide/FAM/Cy3/Cy5四通道滤光片
Agilent 1260 Infinity II HPLC系统
• 二元梯度泵精度：±0.15% RSD
• 柱温箱控温范围：4-80℃±0.5℃
• 二极管阵列检测器波长精度：±1nm
Tycho NT.6蛋白质稳定性分析仪
• 温度分辨率：0.05℃
• 样品通量：6个/批次
• 可同步测定Tm值及聚集起始温度（Tagg）
