蛋白泛素化实验

蛋白泛素化的类型

　　修饰分为单泛素化修饰和多聚泛素化修饰，多聚泛素化修饰包括K6、K11、K27、k29、k33、k48、k63位的修饰，其中k48、k63位的研究比较多，k48位的多聚泛素化修饰主要起降解和调控蛋白稳定性的作用，k63位的作用主要是信号转导、DNA修复和调控蛋白的活性。

蛋白泛素化实验方法

1.western blot and immunoprecipitations

　　通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。

2.western blot and strip

　　通过western blot检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。

3.in vitro ubiquitin-binding assay

　　将我们要研究的蛋白(被泛素化的蛋白)基因转染293细胞，大量表达后提纯。或者直接提取内源性蛋白。在体外与K63- or K48-pnked ubiquitin chain petides孵育，然后通过SDS电泳并用泛素化抗体进行检测。这一方法可以明确要研究的蛋白哪个赖氨酸残基容易发生泛素化。

4.in vitro ubiquitination assay

　　将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A(被泛素化的那个蛋白)与UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin以及我们要研究的蛋白B(引起蛋白A泛素化的蛋白)，共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。这一方法可以明确引起哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的E3连接酶。

蛋白质泛素化降解过程

　　泛素化降解蛋白质需要通过泛素化蛋白酶体来实现，蛋白酶体存在于细胞质和细胞核，是一种由十到二十个亚基组成的蛋白复合物。在生物细胞体内普遍存在的是26s蛋白酶体，它的组成分为两部分，一部分是20s蛋白酶体，是核心的成分，另一部分是两个19s蛋白酶体，起调节作用。细胞内的大部分蛋白质都是由26s蛋白酶体降解的。靶蛋白的泛素化降解是经过几个连续的过程来完成的：

　　1)在ATP供给能量的情况下，泛素激活酶E1将泛素分子活化;

　　2)泛素激活酶E1将活化的泛素分子传递给泛素结合酶E2;

　　3)泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到靶蛋白上;

　　4)26s蛋白酶体特异性地识别这个带有泛素标签的底物蛋白，将其降解掉。

　　以上是关于蛋白泛素化实验相关的简单介绍，具体试验/检测周期、方法和步骤以与工程师沟通为准。北检研究院将持续跟进新的技术和标准，工程师会根据不同产品类型的特点，选取相应的检测项目和方法，以最大程度满足客户的需求和市场的要求。