RNA干扰凝胶成像系统沉默效率检测

检测项目

目标基因mRNA水平检测：通过RT-qPCR或Northern Blot验证目标基因转录本丰度的下降。

目标蛋白表达水平检测：利用Western Blot或免疫荧光技术检测蛋白产物的表达抑制情况。

内参基因稳定性验证：评估实验所用内参基因（如GAPDH, β-actin）在干扰条件下的表达稳定性。

非特异性沉默效应评估：检测与目标基因序列相似的其他基因是否被脱靶沉默。

细胞活力与毒性检测：评估RNAi处理本身对细胞增殖和存活率的影响。

干扰序列效率筛选：比较针对同一基因不同位点的多条siRNA/shRNA的沉默效果。

剂量依赖性效应分析：研究不同转染浓度或剂量的干扰分子对沉默效率的影响。

时间动力学过程监测：追踪RNAi效应从开始到衰减的整个时间进程。

阴性对照与阳性对照设置：设立无关序列阴性对照和已知有效阳性对照，确保实验可靠性。

凝胶图像定量分析：对凝胶成像结果进行光密度扫描和统计学分析，获得定量数据。

检测范围

体外培养的哺乳动物细胞系：适用于HeLa、HEK293、HepG2等多种贴壁或悬浮细胞。

植物组织与原生质体：可用于研究植物基因功能，检测植物体内的RNAi效应。

昆虫细胞系：适用于基于Sf9、S2等细胞的基因功能研究与病毒防控。

线虫等模式生物：可用于通过喂食或注射dsRNA后，检测整体或特定组织的基因沉默。

初级细胞与干细胞：涵盖从组织中分离的原代细胞及多种类型的干细胞。

体内局部给药模型：适用于在小鼠等动物模型局部注射siRNA后，取组织进行效率检测。

病毒载体介导的稳定干扰：检测通过慢病毒、腺病毒等载体整合的shRNA的长期沉默效果。

高通量筛选平台验证作为二次验证手段，确认高通量筛选中获得的候选干扰序列的有效性。

药物与RNAi联合治疗研究：评估RNAi与化学药物联用时对基因表达的协同抑制效应。

基因功能研究与信号通路解析：广泛应用于分子生物学基础研究，用于阐明特定基因的生物学功能。

检测方法

TRIzul法提取总RNA：使用酚-氯仿异戊醇法从细胞或组织中高效分离完整的总RNA。

琼脂糖凝胶电泳：通过电泳分离RNA样品，初步评估RNA完整性及降解情况。

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）：将mRNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增，半定量检测基因表达。

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）：通过荧光信号实时监测PCR过程，定量目标mRNA的相对变化。

蛋白质免疫印迹（Western Blot）：通过SDS-PAGE分离蛋白，转膜后利用特异性抗体检测目标蛋白水平。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）: 用于根据分子量大小分离蛋白质样品，为Western Blot提供前提。

凝胶成像系统捕获与分析: 使用特定光源（如紫外、蓝光）激发荧光染料（如EB, SYBR），由CCD相机捕获图像，并用软件分析条带强度。

密度测定法: 利用凝胶分析软件对目标条带和内参条带进行光密度积分，计算相对表达量。

统计学分析: 采用t检验、方差分析等方法对多组实验数据进行差异显著性检验。

标准化与归一化处理: 将目标基因的信号值除以内参基因的信号值，以校正上样量和实验误差。

检测仪器设备

核酸蛋白定量仪: 用于测量RNA和蛋白质样品的浓度与纯度（A260/A280比值）。

PCR仪与实时荧光定量PCR仪: 前者用于常规PCR扩增，后者用于进行高灵敏度的定量PCR反应。

电泳系统: 包括电泳槽和电源，用于进行琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

化学发光凝胶成像系统: 核心设备，配备CCD相机、多种光源（透射紫外、反射白光、激光等）和滤光片，用于捕获EB、SYBR等染料染色的核酸凝胶及化学发光Western Blot膜图像。

多功能酶标仪: 可用于进行细胞活力（如CCK-8）等辅助检测，部分型号也具备荧光定量功能。

高速冷冻离心机: 用于样本制备过程中的细胞收集、核酸沉淀等步骤。