蛋白质印迹法表达验证

检测项目

目标蛋白特异性检测：利用特异性抗体验证样品中是否存在目标蛋白，是表达验证的核心。

蛋白分子量确定：通过与预染蛋白Marker对比，确认目标蛋白的表观分子量是否正确。

蛋白表达水平半定量：通过内参蛋白校正，比较不同样品间目标蛋白的相对表达量差异。

蛋白翻译后修饰检测：如磷酸化、糖基化、乙酰化等，需使用修饰特异性抗体进行检测。

蛋白剪切体或异构体鉴定：验证特定剪切变体或异构体的存在及其表达水平。

蛋白二聚体或多聚体分析：检测目标蛋白是否以多聚体形式存在，通常在非还原条件下进行。

重组蛋白表达验证：在基因工程中，验证外源基因是否成功表达出目的重组蛋白。

基因敲除/敲低效率验证：在基因功能研究中，确认干预后目标蛋白表达是否被成功下调或消除。

信号通路激活状态评估：通过检测通路中关键蛋白及其磷酸化水平，判断信号通路的活性。

抗体特异性验证：作为反向应用，使用已知表达样本验证新购或自制抗体的特异性和有效性。

检测范围

细胞裂解液：最常用的样本类型，包括贴壁细胞、悬浮细胞或组织原代细胞的裂解物。

组织匀浆液：来自动物或临床样本的组织，经研磨裂解后用于组织特异性蛋白表达分析。

细菌或酵母裂解物：用于验证原核或真核微生物中外源蛋白的表达情况。

血清或血浆样本：检测血液中特定分泌蛋白、抗体或疾病标志物的存在与水平。

细胞培养上清：用于分析细胞分泌到培养基中的蛋白，如细胞因子、外泌体相关蛋白。

亚细胞组分：如细胞核、线粒体、胞浆等分离组分，用于蛋白的亚细胞定位研究。

免疫共沉淀产物：验证免疫共沉淀（Co-IP）实验中是否成功富集到目标蛋白及其互作蛋白。

纯化蛋白样品：对纯化后的重组蛋白进行鉴定和纯度粗略评估。

植物组织提取物：应用于植物分子生物学研究，检测植物体内特定蛋白的表达。

石蜡包埋组织切片提取物：从FFPE样本中提取的蛋白质，可用于回顾性临床研究。

检测方法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：根据分子量大小分离蛋白质混合物的核心第一步。

蛋白质转膜：将凝胶中分离的蛋白转移到固相支持膜（如PVDF或NC膜）上，常用湿转或半干转法。

膜封闭：使用脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景信号。

一抗孵育：使用针对目标蛋白的特异性一抗与膜上的靶蛋白进行特异性结合。

二抗孵育：使用偶联了报告酶（如HRP）或荧光基团的二抗与一抗结合，用于信号放大与检测。

化学发光法检测：最常用的方法，HRP催化底物产生化学发光信号，通过X光胶片或成像系统捕获。

荧光法检测：使用荧光标记的二抗，通过荧光扫描仪直接成像，可实现多重检测。

显色法检测：使用能产生不溶性有色沉淀的底物（如DAB/NBT），直接在膜上显色观察。

内参蛋白检测：使用看家蛋白（如β-actin, GAPDH）抗体作为内参，对上样量进行均一化校正。

图像分析与定量：使用专业软件（如ImageJ）对条带灰度值进行分析，计算相对表达量。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，实现蛋白质根据分子量的初步分离。

电转仪：提供稳定电场，将凝胶中的蛋白质高效转移至固相膜上。

摇床：用于转膜后膜的封闭、抗体孵育及洗膜过程，确保反应均匀充分。

化学发光成像系统：核心检测设备，用于捕获和记录化学发光信号，具有高灵敏度。

荧光扫描成像仪：用于检测荧光标记的抗体信号，适用于多重Western Blot分析。

凝胶成像系统（带白光板）：用于拍摄考马斯亮蓝染色胶或显色法WB的膜，进行总蛋白评估或结果记录。

微量移液器及电泳电源

微量移液器：移取样品、试剂和上样量的关键工具，确保实验重复性。