蛋白免疫印迹表达量检测

检测项目

总蛋白提取与定量：从细胞或组织样本中裂解释放总蛋白质，并通过BCA或Bradford法测定其浓度，为后续上样均一化提供依据。

目标蛋白特异性检测：利用抗原-抗体特异性结合原理，检测样本中特定目标蛋白的存在与否。

蛋白表达水平半定量分析：通过比较不同样本间目标蛋白条带的信号强度，进行相对表达量的比较和分析。

蛋白分子量确定：通过与预染蛋白Marker对比，估算目标蛋白的表观分子量，验证其是否正确。

蛋白翻译后修饰检测：使用识别特定修饰（如磷酸化、乙酰化、泛素化）位点的抗体，检测蛋白的修饰状态和水平。

蛋白亚细胞定位指示：通过检测不同亚细胞组分（如胞浆、胞核、膜蛋白）提取物中的目标蛋白，间接推断其定位。

蛋白复合物存在验证：结合免疫共沉淀等技术，验证目标蛋白是否存在于特定的蛋白复合物中。

抗体特异性验证：通过敲低/敲除目标基因的阴性对照样本，验证所用一抗的特异性。

信号通路激活状态评估：检测信号通路中关键蛋白（如激酶）及其磷酸化形式的水平，评估通路活性。

疾病生物标志物筛选：通过比较疾病组与对照组样本的蛋白表达谱，寻找潜在的诊断或预后标志物。

检测范围

细胞培养样本：适用于贴壁细胞、悬浮细胞、原代细胞等各类培养细胞的全细胞裂解液或组分蛋白。

动物组织样本：适用于小鼠、大鼠、兔等实验动物的心、肝、脾、肺、肾、脑等多种组织分浆蛋白。

植物组织样本：适用于拟南芥、水稻、烟草等植物的叶片、根、茎、种子等组织的蛋白提取物。

细菌与酵母样本：适用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等微生物的重组或内源蛋白表达检测。

临床样本：适用于经过伦理批准的血清、血浆、组织切片、石蜡包埋组织提取的蛋白质样品。

重组蛋白样品：适用于体外表达纯化的重组蛋白的鉴定和浓度粗略估计。

病毒蛋白样品：适用于病毒感染细胞或纯化病毒颗粒中特定病毒蛋白的检测。

亚细胞组分蛋白：适用于通过差速离心等方法分离的线粒体、细胞核、微粒体等细胞器蛋白。

免疫沉淀产物：适用于经过Co-IP或Pull-down实验富集后的特定蛋白或蛋白复合物。

分泌蛋白与胞外囊泡：适用于细胞培养上清液、血清、外泌体等样品中分泌型或囊泡相关蛋白的检测。

检测方法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：根据分子量大小，在电场作用下将变性的蛋白质混合物在凝胶中进行分离。

湿转法或半干转法：将凝胶中分离的蛋白质条带通过电转移方式印迹到固相支持膜（如PVDF膜或NC膜）上。

膜封闭：使用脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少后续抗体的非特异性吸附。

一抗孵育：用针对目标蛋白的特异性一抗与膜上的抗原在适宜条件下进行孵育结合。

二抗孵育：用带有酶（HRP）或荧光标记的、针对一抗种属的二抗进行孵育，放大检测信号。

化学发光法检测：加入HRP的底物（如ECL试剂），在酶催化下发生化学反应并产生荧光，通过X光胶片或成像系统捕获信号。

荧光法检测：使用带有不同荧光基团（如Cy3, Cy5）的二抗，直接在荧光成像仪下扫描检测，可实现多重检测。

内参蛋白检测：平行检测样本中稳定表达的管家蛋白（如β-actin, GAPDH），用于校正上样量和实验误差。

图像采集与分析：使用凝胶成像系统采集条带图像，并用ImageJ等专业软件进行灰度值定量分析。

数据标准化与统计：将目标蛋白条带灰度值与对应内参条带灰度值相除得到相对表达量，再进行组间统计学分析。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，配备玻璃板、梳子等，形成凝胶并完成蛋白质电泳分离。

电转仪：提供稳定电场，将凝胶中的蛋白质高效、均匀地转移至固相膜上，分为湿转槽和半干转仪。

电源：为电泳和转膜过程提供稳定、可调节电压和电流的直流电源，通常具有恒压/恒流模式。

摇床：用于孵育过程中的温和振荡，确保抗体或封闭液与膜充分、均匀接触，提高反应效率。

化学发光成像系统：核心检测设备，包含高灵敏度CCD相机和暗箱，用于捕获和记录化学发光信号。

荧光成像系统：配备特定激发和发射滤光片，用于检测和区分不同荧光标记二抗发出的信号。

分析天平：称量化学试剂、组织样本等，保证溶液配制和样品处理的准确性。

pH计：测量和调节各种缓冲液（如电泳缓冲液、转膜缓冲液）的pH值，确保实验条件稳定。

微量移液器

检测优势

1. 确保安全：通过检测可以确保防爆用呆扳手的安全性，防止在使用过程中引发火灾或爆炸。

2. 提高质量：通过检测可以提高防爆用呆扳手的产品质量，增强其市场竞争力。

3. 延长使用寿命：通过检测可以发现呆扳手的潜在问题，及时进行维修和更换，延长其使用寿命。

4. 降低维护成本：通过定期检测可以及时发现呆扳手的问题，避免因故障导致的停机和维修成本。

5. 提高工作效率：通过检测可以确保呆扳手的正常使用，提高工作效率，减少因工具故障导致的生产损失。