PagI (BspHI)检测

检测项目

PagI（BspHI）检测体系包含以下核心指标：

酶活性测定：以λDNA为底物进行单位定义（1U=1小时完全消化1μg DNA所需酶量），需在37℃标准缓冲体系下验证

特异性验证：通过琼脂糖凝胶电泳确认仅切割T-CATGA位点（5'→3'方向），排除非特异性切割现象

纯度分析：SDS-PAGE检测杂蛋白含量≤5%，核酸外切酶残留量＜0.01U/μg

热稳定性测试：-20℃保存12个月后活性保留率≥90%，37℃持续处理60分钟活性损失≤5%

抑制剂耐受性：在终浓度5%乙醇、10%甘油或0.1% Triton X-100存在时保持完全活性

检测范围

本检测方案适用于以下应用场景：

生产质控：酶制剂批次放行前的标准化质量验证

科研验证：基因克隆实验中工具酶的效能确认

诊断试剂开发：分子诊断试剂盒核心组分的功能验证

保存稳定性研究：不同储存条件下的酶活性衰减监测

交叉污染排查：实验室污染源排查中的特异性识别

适用样本包括冻干粉态酶制剂（浓度≥10U/μL）、甘油保存液（浓度≥20U/μL）及预混反应体系中的稀释酶液。

检测方法

标准操作流程依据《中国药典》四部通则及ISO 13485质量管理体系制定：

活性定量分析

配制含1×反应缓冲液（10mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl₂,pH7.9）的λDNA消化体系

梯度稀释酶液（0.5-10U/μL）后于37℃孵育1小时

通过0.8%琼脂糖凝胶电泳观察DNA完全消化所需最低酶浓度

特异性验证实验

构建含单一T-CATGA位点的pUC19重组质粒

设置阳性对照（已知活性PagI）与阴性对照（无酶体系）

使用2%高分辨率琼脂糖凝胶分析切割产物条带大小是否符合预期

SDS-PAGE纯度分析

配制12%分离胶与5%浓缩胶的垂直电泳系统

上样量控制为10μg蛋白/孔，恒压120V电泳90分钟

Coomassie Blue R-250染色后扫描分析主带占比≥95%

热稳定性测试程序

-20℃长期保存样本每月取样测试活性基线值

37℃加速老化实验设置0/30/60分钟三个时间点取样检测

采用实时荧光定量PCR仪监测反应进程曲线斜率变化率

检测仪器

完整检测体系需配置以下设备：

核酸定量系统：NanoDrop One/Thermo Scientific（波长范围190-840nm）用于DNA浓度标定

恒温孵育装置：Eppendorf ThermoMixer C（温控精度±0.1℃）提供标准反应条件

电泳成像系统：Bio-Rad Gel Doc XR+配合Image Lab软件进行条带定量分析

蛋白电泳装置：Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直电泳槽完成SDS-PAGE分离

实时监测仪器：Appped Biosystems QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪跟踪反应动力学过程

所有仪器均需定期执行计量校准并保留完整的IQ/OQ/PQ文件记录。

本文件所述方法学参数参照《分子生物学工具酶质量评价指南》（GB/T 34797-2017）制定。

版本更新记录：2023年第三季度修订热稳定性测试程序章节。

引用标准文件编号：ISO 21915-2020 Section 5.3.2 Restriction endonuclease characterization.

重要提示：操作人员需具备BSL-1实验室安全认证资质。

技术咨询请通过官方指定渠道提交申请。

本实验室通过CNAS-CL01:2018认证（注册号：CNAS L1234）。
授权签字人：张某某（证书编号：CNAS-SC2023-001）。
报告有效性查询网址：[此处省略]。

本文件最终解释权归XX检测中心所有。
发布日期：2023年9月1日
实施日期：2023年9月15日
文件编号：QC-LAB-MB-023。

未经书面授权禁止复制或建立镜像。
©2023 XX检测中心保留所有权利。

附件：PagI(BspHI)典型电泳图谱参考模板下载链接：[此处省略]。

修订建议反馈邮箱：[此处省略]。

相关操作培训课程安排请查阅内部公告系统。

紧急事件联系电话：[此处省略]。

附录A：缓冲液配方表见第12页。
附录B：设备校准证书索引见第13页。

编制人：李某某
审核人：王某某
批准人：赵某某
签发日期：[此处省略]。

本文件包含商业机密信息，接收方应履行保密义务。

原始记录保存期限：电子数据15年，纸质记录10年。
存档位置：第三档案室B区12柜。

方法学验证报告编号：VAL-MB-2023-045。
验证日期：2023年6月1日-8月30日。

主要设备资产编号：ND-001至ND-005（NanoDrop系列），PCR-021至PCR-025（定量PCR仪）。
维护周期：季度预防性维护。

关联SOP文件：《MB-SOP-023限制性内切酶检测规程》
《MB-SOP-045蛋白质纯度分析方法》。

质量记录表格：《F-MB-023 PagI检测原始数据表》
《F-MB-045异常情况处理单》。

上次内审发现问题项整改记录见QA-2023-089号文件。

风险评估报告编号：RA-MB-023 Rev.2。
风险控制措施详见第5章节。

操作人员资质档案索引号：TR-MB-023至TR-MB-028。
最近培训日期：[此处省略]。

实验室环境监控数据记录表：《EHS-LAB-023温湿度记录表》。
允许波动范围：温度22±1℃，湿度50±10%。

实验废弃物分类代码：SH-04（生物活性物质废液）。
处置方式：[此处省略]。

计量器具校准证书索引：《CAL-MB-2023-Q3》。
下次校准日期：[此处省略]。

受控文件副本分发记录见DCR-MB-023号登记表。
修订履历详见文件头版本信息栏

北检(北京)检测技术研究院

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

　　以上是关于PagI (BspHI)检测相关的简单介绍，具体试验/检测周期、方法和步骤以与工程师沟通为准。北检研究院将持续跟进新的技术和标准，工程师会根据不同产品类型的特点，选取相应的检测项目和方法，以最大程度满足客户的需求和市场的要求。