Fuw-dCas9-Dnmt3a-IM检测

检测项目

本检测体系包含以下标准化项目：

Fuw-dCas9-Dnmt3a重组质粒完整性验证：包括载体骨架序列比对、融合蛋白编码框开放阅读验证及限制性内切酶图谱分析

靶向DNA甲基化效率测定：通过亚硫酸氢盐转化结合焦磷酸测序技术对sgRNA引导的特定位点进行CpH位点（H=A/T/C）甲基化水平定量

脱靶效应评估：采用全基因组甲基化测序（WGBS）与靶向区域捕获测序进行非特异性甲基化修饰筛查

细胞转染效率标准化检测：流式细胞术定量报告基因（如EGFP）表达阳性率及荧光强度分布

功能相关性分析：qRT-PCR测定靶基因转录抑制效率与甲基化修饰程度的剂量效应关系

检测范围

本方法适用于以下研究场景：

基础医学研究中特定基因启动子区/增强子区的表观遗传调控机制解析

肿瘤表观遗传学模型中抑癌基因异常甲基化状态的重建与验证

干细胞定向分化过程中关键转录因子沉默的甲基化动力学研究

神经退行性疾病相关基因（如APP、MAPT）年龄相关性甲基化修饰分析

基因编辑工具脱靶效应的系统性评估与优化方案开发

检测方法

标准化操作流程包含以下关键技术节点：

质粒构建验证：采用Sanger测序确认dCas9-Dnmt3a融合结构域连接序列的正确性；通过Western Blot使用anti-FLAG抗体（dCas9标签）和anti-Dnmt3a抗体进行融合蛋白表达验证

细胞转染体系优化：使用HEK293T等标准细胞系进行脂质体转染参数优化（质粒浓度梯度：0.5-4μg/ml；转染时间梯度：24-72h）

甲基化水平测定：亚硫酸氢盐处理DNA样本后，采用Methylation-Specific PCR（引物设计Tm值差异≥10℃）进行定性筛查；焦磷酸测序平台（PyroMark Q96 ID）进行CpG岛单碱基分辨率定量分析（覆盖度≥500×）

全基因组脱靶筛查

全基因组脱靶筛查：使用Nextera DNA Library Prep Kit构建全基因组甲基化文库，Illumina NovaSeq 6000平台进行150bp双端测序（数据量≥30Gb/sample），经Bismark软件比对后筛选差异甲基化区域（DMRs）

功能验证实验：通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）确认Dnmt3a在靶标区域的富集程度；RNA-seq分析差异表达基因与甲基化修饰的时空相关性

检测仪器

核酸定量系统：Thermo Fisher Qubit 4.0荧光计（检测范围0.1-60ng/μl）配合dsDNA HS Assay Kit

电泳成像系统：Bio-Rad ChemiDoc MP全自动化学发光成像仪（像素密度4.2MP），支持SYBR Safe染色凝胶分析

焦磷酸测序仪：Qiagen PyroMark Q96 ID系统（分辨率0.5%甲基化差异），配套PyroMark CpG Assay设计软件

高通量测序平台：Illumina NovaSeq 6000测序仪（输出量6-20Tb/run），配合S4流动槽实现全基因组甲基化深度覆盖

流式细胞分析仪：BD FACSAria III配置488nm/640nm双激光系统，支持FSC/SSC双参数门控分析转染效率

实时定量PCR系统：Appped Biosystems QuantStudio 6 Flex（动态范围10^8），配合TaqMan探针实现绝对定量分析

北检(北京)检测技术研究院

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

　　以上是关于Fuw-dCas9-Dnmt3a-IM检测相关的简单介绍，具体试验/检测周期、方法和步骤以与工程师沟通为准。北检研究院将持续跟进新的技术和标准，工程师会根据不同产品类型的特点，选取相应的检测项目和方法，以最大程度满足客户的需求和市场的要求。